2020年2月27日，中科院生物物理研究所王大成/丁璟珒研究組和北京生命科學(xué)研究所邵峰院士團隊合作，在國際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊《Cell》在線發(fā)表題為“Structural Mechanism for GSDMD Targeting by Autoprocessed Caspases in Pyroptosis”的研究論文。該研究完整地揭示了天然免疫應(yīng)答中caspase精確地自剪切活化，進而特異地識別和切割GSDMD，引發(fā)細胞焦亡的分子機制。 細胞焦亡是機體重要的天然免疫反應(yīng)，在拮抗和清除病原菌感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，過度的細胞焦亡會誘發(fā)包括敗血癥在內(nèi)的多種炎癥性疾病。2015年邵峰團隊的一項重要工作，是發(fā)現(xiàn)天然免疫中細胞焦亡是通過活化的半胱氨酸蛋白酶caspase-1和caspase-4/5/11切割共同的底物蛋白GSDMD而引發(fā)（Shi et al., Nature 2015）。隨后王大成/丁璟珒研究組與邵峰團隊合作，進一步證明GSDMD是細胞焦亡的執(zhí)行蛋白，活化的caspase切割GSDMD蛋白N端和C端結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)，釋放具有結(jié)合膜磷脂上膜打孔活性的N端結(jié)構(gòu)域，進而破壞細胞膜引發(fā)細胞焦亡（Ding et al., Nature 2016）。然而，天然免疫中caspase在響應(yīng)上游信號后如何活化，活化的caspase又是如何特異地識別和切割GSDMD的精確分子機制仍然不清楚，這也是細胞焦亡研究的關(guān)鍵科學(xué)問題。 Caspase-1和caspase-4/11屬于保守的半胱氨酸蛋白酶caspase家族，該家族因在細胞凋亡通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用而被廣泛研究，caspase以非激活的酶原形式存在于細胞質(zhì)中，在響應(yīng)上游信號后通過分子內(nèi)或分子間的剪切形成由大亞基p20和小亞基p10組成的異源二聚體而激活。研究人員進一步發(fā)現(xiàn)LPS激活的caspase-4同樣會發(fā)生分子內(nèi)自剪切，和caspase-11的特異性自剪切發(fā)生在p10亞基的N端所不同，caspase-4的自剪切會同時發(fā)生在p20亞基的C端以及p10亞基的N端兩個位點。進一步突變實驗發(fā)現(xiàn)，只有發(fā)生在p10亞基的N端保守的自剪切對于caspase-4的活化以及GSDMD的切割至關(guān)重要。 傳統(tǒng)上對caspase蛋白酶的一個重要的認識，是其通過識別底物蛋白中具有xxxD（D為天冬氨酸，x為其它氨基酸）序列特征的四肽并在D后切割肽鍵實現(xiàn)對底物蛋白的活化，不同caspase對四肽序列的選擇性偏好不同從而具有不同的底物識別譜。不同于細胞凋亡通路中的caspase會切割多種底物蛋白，GSDMD是caspase-4/5/11目前已知的唯一生理底物，caspase-1除了共享GSDMD作為底物以外，只能切割IL-1β/18兩種細胞因子幫助其成熟和分泌。因此識別四肽的特征很難解釋天然免疫中這些caspase狹窄的底物識別譜。研究人員隨后意外地發(fā)現(xiàn)caspase-4/11特異地識別GSDMD蛋白的C端結(jié)構(gòu)域而不是切割位點的四肽序列。在此基礎(chǔ)上，研究人員成功地測定了自剪切激活形式的caspase-4/11與GSDMD的C端結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，三維結(jié)構(gòu)清晰地揭示了caspase-4/11的p20/p10異源二聚體進一步通過二聚化形成四聚體，在四聚體的界面上形成一個分子間的β折疊，這個β折疊獨立于caspase的半胱氨酸活性中心，伸展向四聚體的外部，像一把鑰匙插入到GSDMD C端結(jié)構(gòu)域的一個疏水口袋中，由于活化的caspase四聚體具有兩個對稱的分子間β折疊，因此caspase-4/11和GSDMD的C端結(jié)構(gòu)域形成了一個2：2狀態(tài)的酶-底物復(fù)合物。復(fù)合物的分子界面也很好地解釋了p10 N端的延長會導(dǎo)致與GSDMD C端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)沖突，因此活化的caspase需要在p10 N端發(fā)生精確的自剪切才能獲得GSDMD識別與切割的能力，這與功能研究的結(jié)果一致�；诮Y(jié)構(gòu)設(shè)計的定點突變實驗進一步證明三維結(jié)構(gòu)揭示的保守作用方式就是活化的caspase-4/11特異地識別和切割GSDMD介導(dǎo)細胞焦亡的分子基礎(chǔ)。隨后研究人員進一步通過生化和細胞實驗，以及caspase-1和GSDMD C端結(jié)構(gòu)域復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析，證明了自剪切活化的caspase-1采用和caspase-4/11完全相同的方式，通過特異地識別GSDMD的C端結(jié)構(gòu)域來實現(xiàn)對底物GSDMD的切割和活化。 這項系統(tǒng)的研究工作，在國際上首次揭示了天然免疫中caspase自剪切活化和特異地識別GSDMD介導(dǎo)細胞焦亡的完整分子機理，也是caspase從發(fā)現(xiàn)至今首次獲得與生理底物復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，為caspase酶活機制和底物識別機制研究提供了全面深入的理解。具有重要生理功能的caspase一直都是重要的潛在藥物靶標，但是由于caspase酶活中心具有很高的保守性，因此針對某一caspase開發(fā)的抑制劑很難具有高度特異的選擇性。這項研究發(fā)現(xiàn)的獨立于酶活中心的全新底物識別位點，為針對caspase和GSDMD開發(fā)自身炎癥性疾病和敗血癥的藥物提供了一個重要的新方向。 
中科院生物物理研究所丁璟珒研究員（青促會會員）和北京生命科學(xué)研究所邵峰院士為本文的共同通訊作者，該研究得到中科院戰(zhàn)略先導(dǎo)科技專項，國家自然科學(xué)基金基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中心項目和優(yōu)青項目，科技部重點研發(fā)計劃，中國醫(yī)科院創(chuàng)新醫(yī)學(xué)單元項目和中科院青年創(chuàng)新促進會的共同資助。 論文鏈接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30146-X
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