近日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所李家洋團(tuán)隊在多亞基SCF E3連接酶的體外重組研究中取得重要進(jìn)展，相關(guān)成果以“An engineered platform for reconstituting functional multisubunit SCF E3 ligase in vitro”為題，于2022年6月24日在國際學(xué)術(shù)期刊Molecular Plant雜志在線發(fā)表(DOI: 10.1016/j.molp.2022.06.011) 蛋白質(zhì)合成與降解間的平衡，對于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及機(jī)體的正常功能具有重要作用。泛素-蛋白酶體途徑是真核細(xì)胞中蛋白降解的主要途徑之一，目標(biāo)蛋白的泛素化修飾由泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)協(xié)同完成。SCF (SKP1/Cullin1/F-box) E3連接酶是一類多亞基RING E3連接酶，由SKP1蛋白、Cullin1蛋白、RBX1蛋白和可變的F-box蛋白組成，廣泛存在于真核生物中，在生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。 建立體外泛素化修飾檢測系統(tǒng)對于研究E3泛素連接酶和底物蛋白的特異識別關(guān)系及其在生長發(fā)育中的分子機(jī)理十分重要。然而由于多亞基SCF E3泛素連接酶的組成比較復(fù)雜，獲得具有活性的E3復(fù)合體組分并鑒定與其特異協(xié)同工作的E2存在較大困難，到目前為止，植物來源的多亞基SCF E3泛素連接酶的體外活性重組體系仍然是空白。 李家洋團(tuán)隊長期從事植物激素獨(dú)腳金內(nèi)酯相關(guān)分子機(jī)理研究，前期研究發(fā)現(xiàn)在獨(dú)腳金內(nèi)酯信號通路中，獨(dú)腳金內(nèi)酯促進(jìn)其受體蛋白D14與F-box蛋白D3以及底物蛋白D53互作，SCFD3 E3連接酶進(jìn)而對D53蛋白進(jìn)行泛素化修飾和降解，解除D53蛋白對下游基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用（Jiang et al., Nature 2013; Wang et al., Nature 2020）。其中，D53蛋白的泛素化是獨(dú)腳金內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵事件。 為深入研究SCF E3連接酶對底物蛋白進(jìn)行泛素化修飾的作用機(jī)理，研究團(tuán)隊以水稻的SCFD3 E3連接酶為出發(fā)點(diǎn)，通過質(zhì)譜鑒定了SCFD3 E3復(fù)合體組分并在原核、真核系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)純化，進(jìn)一步篩選了能與SCFD3 E3連接酶協(xié)同工作的E2，并在體外重組了有活性的SCFD3 E3連接酶。為提高重組效率，研究團(tuán)隊設(shè)計了串聯(lián)融合蛋白SKP1-Cullin1-RBX1 (eSCR)，并利用eSCR融合蛋白在體外重組了有活性的eSCFD3 E3連接酶。SCFD3 E3和eSCFD3 E3連接酶均能在體外催化底物蛋白D53的泛素化修飾，加入受體蛋白D14和獨(dú)腳金內(nèi)酯人工合成類似物rac-GR24能夠進(jìn)一步增強(qiáng)D53蛋白的泛素化水平，與內(nèi)源獨(dú)腳金內(nèi)酯信號傳導(dǎo)相一致，說明利用該體外系統(tǒng)能夠反映內(nèi)源獨(dú)腳金內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的狀態(tài)，為深入研究不同植物中獨(dú)腳金內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供了新的技術(shù)體系。 該研究進(jìn)一步以eSCR為骨架蛋白，與水稻赤霉素信號途徑的F-box蛋白GID2重組，獲得了有活性的eSCFGID2 E3泛素連接酶；與調(diào)控人類腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵F-box蛋白CDC4和調(diào)控人類細(xì)胞分裂過程的關(guān)鍵F-box蛋白Fbxl18分別進(jìn)行體外重組，獲得有活性的eSCFCDC4 E3和eSCFFbx118 E3泛素連接酶，其中，eSCFCDC4 E3能夠在體外對其底物蛋白HsSic1進(jìn)行泛素化修飾。因此，該技術(shù)在真核生物多亞基SCF E3泛素連接酶研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。 
圖：多亞基SCF E3泛素連接酶體外活性重組方法技術(shù)平臺展示 (A)利用表達(dá)純化的SKP1、Cullin1、RBX1、D3、OsUb、OsE1和OsE2(OsUBC14)，在體外重組有活性的SCFD3 E3泛素連接酶。(B)利用SKP1-Cullin1-RBX1 (eSCR)融合蛋白，在體外重組有活性的eSCFD3 E3泛素連接酶。(C) eSCR融合蛋白能夠與不同的F-box重組出多種eSCF E3，在體外實(shí)現(xiàn)底物蛋白的泛素化修飾。紅色方塊代表NEDD8修飾。 本項成果為解析多亞基SCF E3泛素連接酶與其底物蛋白的特異性識別關(guān)系提供了可靠的系統(tǒng)，為研究激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、鑒定癌癥治療靶標(biāo)及其他生物學(xué)過程提供了重要的平臺。 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所為該論文第一單位，劉會會博士為論文的第一作者，李家洋研究員和王冰青年研究員(第9批會員)為共同通訊作者。汪迎春研究員、黃夏禾工程師和于菲菲教授參與了本項目的研究。研究得到了國家自然科學(xué)基金和中國科學(xué)院青促會的資助。 | 
